期刊简介
中国科学技术协会主管，中华医学会主办、天津医院承办。本刊创刊至今已有30年，始终是我国骨科领域最权威的学术期刊。30年来，我们始终以学术质量为根本，以促进骨科事业发展为己任，以造福人民为最终目标。目前，我刊已被国内外多家数据库收录，影响因子、被引频次、学术地位等持续领先。作为骨科学术交流平台，我们欢迎各种类型的稿件，请关注我们、信赖我们、支持我们、与我们一同进步。
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首页>中华骨科杂志
- 杂志名称：中华骨科杂志
- 主管单位：中国科学技术协会
- 主办单位：中华医学会
- 国际刊号：0253-2352
- 国内刊号：12-1113/R
- 出版周期：半月刊
期刊荣誉：期刊收录：哥白尼索引(波兰), 万方收录(中), JST 日本科学技术振兴机构数据库(日), 剑桥科学文摘, 统计源核心期刊(中国科技论文核心期刊), 维普收录(中), 文摘杂志, 知网收录(中), CA 化学文摘(美), 国家图书馆馆藏, 上海图书馆馆藏, 北大核心期刊(中国人文社会科学核心期刊), CSCD 中国科学引文数据库来源期刊(含扩展版)
大鼠LC3B荧光融合表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的自噬检测应用
廖翠玲；章淼锋；孙继红；董江军；朱园园；叶招明；邹飞雁
关键词：自噬, 克隆, 分子, 荧光抗体技术
摘要：目的 构建三种rLC3B融合表达载体,探究其在骨肉瘤细胞中的自噬检测应用.方法 采用PCR扩增大鼠LC3B基因序列,克隆至pEGFP-C1和pmCherry-C1,分别构建pEGFP-rLC3B和pmCherry-rLC3B融合表达载体;随后以pEG-FP-rLC3B为模板经PCR得到EGFP-rLC3B序列,克隆至pmCherry-C 1并构建pmCherry-EGFP-rLC3B融合表达载体.将上述三种质粒转染至U-2OS细胞后,采用饥饿和Rapamycin激活自噬,或Chloroquine和Baf-A1抑制自噬,通过激光共聚焦显微镜观察自噬体和自噬溶酶体的形成.采用Western blot检测Rapamycin、Chloroquine和Baf-A1作用下的内源性LC3B和外源性EGFP-rLC3B、mCherry-rLC3B及mCherry-EGFP-rLC3B,验证外源性rLC3B的正确表达和自噬检测功能;采用Western blot检测游离EGFP表达,从而精确检测细胞内的自噬性降解水平.结果 经酶切鉴定和测序验证:成功构建三种融合表达载体.采用饥饿和Rapamycin激活自噬,或Chloroquine和Baf-A1抑制自噬,并在激光共聚焦显微镜下观察到明显的自噬体或自噬溶酶体.Western blot同时检测到内源LC3B和外源rLC3B的表达,并且游离EGFP蛋白的表达随着饥饿时间增加而明显上调,12h组比对照组增加1.05倍,24 h组比对照组增加1.56倍,显示自噬性降解水平升高.结论 EGFP-rLC3B载体可检测自噬体的形成和反应细胞内的自噬性降解水平;mCherry-rLC3B载体可同时显示自噬体和自噬溶酶体,但不能区分这两者;mCherry-EGFP-rLC3B载体可同时显示和区分自噬体和自噬溶酶体,是检测自噬流的佳方法.
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